„Našli jsme způsob, jak přepsat zákony života“, jak se objevila technologie CRISPR-Cas

Co je to za technologii a jak působí na člověka a lidstvo, mimo jiné hovoří ve své knize „Směje se jako matka. Síla a zvláštnosti dědičnosti“ od amerického spisovatele literatury faktu Carla Zimmera. Knihu v ruštině vydalo nakladatelství faktu Alpina v roce 2020. Projekt z něj se svolením držitelů autorských práv publikuje fragment jedné kapitoly – „Daring for the Great“.

Jednoho dne v roce 2006 seděla Jennifer Doudna ve své kanceláři na Kalifornské univerzitě v Berkeley, když jí zazvonil nečekaný telefonát. Mikrobioložka ze stejné univerzity, Jillian Banfield, s ní chtěla probrat nějaký druh Crispera.

Dudna nechápala, o co jde a co po ní její partner chtěl. Banfield, který hledal nové druhy bakterií na vrcholcích hor a na dně oceánů, byl však vědec, se kterým bezpochyby mělo smysl mluvit. V té době Dudna pracoval na molekulách RNA, které byly syntetizovány bakteriemi, lidmi a dalšími organismy. Většina její práce probíhala v klidu a pohodě, chráněná stěnami laboratorní zkumavky. Banfield by s ní mohl sdílet informace o světě mimo zkumavku.

Následující týden se Doudna a Banfield setkali v kavárně. Banfieldová řekla Doudnovi o systému CRISPR, alespoň o všem, co bylo známo do roku 2006. Nakreslila pro Doudnu do svého zápisníku diagram, ukazující opakované sekvence DNA s různými inzerty DNA mezi nimi, které lze vidět u některých bakterií.

V té době Banfield popisoval záplaty CRISPR u jednoho druhu za druhým. A všimla si, že některé z těchto inzertů DNA jsou virového původu. Jiní vědci začali testovat hypotézu, že CRISPR je druh obranného systému, který bakterie používají proti virům, které mohou být zděděny. Nikdo ale nevěděl, jak to funguje. Existovala verze, že bakterie syntetizují molekuly RNA, aby hledaly viry. A protože Doudna byla zkušená specialistka na bakteriální RNA, Banfield se rozhodl zjistit, zda by byla ochotná pomoci to zjistit.

Dudna tuto nabídku přijal. K práci konkrétně na CRISPR si přizvala postdoka Blakea Wiedenhöfta, ale pak postupně celá její laboratoř přešla na toto téma. CRISPR byl také studován v několika dalších výzkumných institucích v té době. V roce 2011 se Dudna spojil s francouzským biologem Emmanuelem Charpentierem a společně zjistili, že systém CRISPR, stejně jako restrikční enzymy [skupina enzymů, které dokážou štěpit nukleové kyseliny], ničí virovou DNA.

Mezi těmito dvěma způsoby ochrany však byl patrný rozdíl. Tvar restrikčních enzymů byl takový, že dokázaly rozpoznat pouze jednu malou sekvenci DNA, která se v genomu mohla vyskytovat mnohokrát. Aby restrikční enzymy nemohly napadnout jejich vlastní DNA, chránily ji bakterie metylací [úprava molekuly DNA bez změny samotné nukleotidové sekvence DNA]. Na druhé straně viry nemohly připojit methylové skupiny ke své DNA, a proto byly zranitelné.

Enzym Cas9, který je součástí systému CRISPR, funguje chytřeji. Bakterie syntetizuje vodící RNA, která může vést enzym do jedné a pouze jedné oblasti DNA. Tím, že si ve svém genomu ponechá oblasti, které odpovídají různým vodicím RNA, je bakterie schopna přesně identifikovat několik různých typů virů.

Protože byla Dudna molekulární bioložka, byla si dobře vědoma toho, že restrikční enzymy pomohly vytvořit biotechnologický průmysl. Napadlo ji, zda by se podobným způsobem dal aplikovat systém CRISPR. Pokud systém dokáže rozpoznat jakoukoli část DNA viru, pak je pravděpodobné, že Dudna a její kolegové budou schopni vytvořit vodicí RNA pro konkrétní oblast v DNA okurky. Nebo hvězdice. Nebo osoba.

Aby tuto myšlenku otestovali, Dudna a její spolupracovníci se pokusili vyříznout jediný genový fragment z kousku DNA medúzy. (Tento gen často využívají molekulární biologové, protože kóduje svítící protein, který pod mikroskopem promění buňku v rozsvícenou baterku.) Dudna a kolegové si pro své účely vybrali fragment o 20 bázích. Dále vědci syntetizovali molekuly RNA vhodné pro tento fragment a vše smíchali ve zkumavce. Vodicí RNA a enzym Cas9 se spárovaly a našly správné geny medúzy. Když Dudna a její kolegové analyzovali zbývající DNA, zjistili, že řez byl proveden přesně na místě, pro které syntetizovali RNA. Vědci provedli další čtyři experimenty s použitím vodicí RNA na různých místech a pokaždé vše fungovalo, jak mělo.

Po zveřejnění všech podrobností tohoto experimentu v roce 2012 Dudnou a kolegy začal start systému CRISPR. Jak Dudnova skupina, tak další pokračovali v zavádění molekul CRISPR do živých buněk. Vědci mohli nejen vyříznout fragmenty z DNA, ale také ji opravit.

V jednom takovém experimentu Feng Zhang a jeho kolegové z Broad Institute v Cambridge ve státě Massachusetts dopravili do lidských buněk pár systémů CRISPR. Molekuly se připojily ke dvěma sousedním cílům v rámci stejného genu a vyřízly mezi nimi krátký úsek DNA. Vlastní enzymy na opravu DNA buňky uchopily dva odříznuté konce a spojily je dohromady. Jinými slovy, tento postup umožnil chirurgicky odstranit kousek DNA bez zanechání jediné jizvy. A když se buňka rozdělila, její potomci tuto změnu zdědili.

20 zajímavých faktů o lidském těle

Výzkumníci brzy začali používat CRISPR k nahrazení oblastí v genech novými sekvencemi. Spolu s enzymy Cas9 a vodící RNA vědci dopravili do buňky malé fragmenty DNA. Poté, co enzymy vyřízly fragment z DNA, buňka zaplnila mezeru vloženými kousky DNA.

CRISPR je radikálním krokem vpřed od restrikčních enzymů a rentgenové mutageneze. Nedávala náhodné mutace – na rozdíl od mutageneze. Navíc neexistovala žádná omezení pro zavádění genu z jednoho organismu do druhého. Protože vědci již věděli, jak od základu syntetizovat krátké fragmenty DNA, měl systém CRISPR potenciál provést jakoukoli požadovanou změnu v genech jakéhokoli organismu.

Ve vzdálených 70. letech 20. století. biolog Rudolf Jenisch z Massachusettského technologického institutu poprvé použil restrikční enzymy k vytvoření geneticky upravených myší. Když se objevilo opakování CRISPR, vědce napadlo, zda by tento systém mohl být použit k vytvoření nových linií myší. Spolu s Feng Zhangem a jeho postgraduálními studenty a spolupracovníky začal manipulovat s CRISPR, dokud nepřišel na chemický protokol, jak dostat tyto molekuly do myších zygot. Vědci dokázali změnit asi pět genů dodáním pěti různých vodicích RNA do buňky. Jenisch a kolegové poté implantovali upravené zygoty do samice myši, kde se z nich vyvinulo normální potomstvo. V 80 % případů výzkumný tým úspěšně obdržel přesně ty změny, které plánoval.

Nové generace doktorandů každý den v duchu děkují Jenischovi za to, že jim usnadnil život. Mnoho dizertačních prací začíná myším modelem nemoci nebo genu. Dříve trvalo získat linii myší obvyklým způsobem rok a půl a k dosažení požadovaného výsledku bylo často zapotřebí několik pokusů. Nyní, s pomocí CRISPR, to Jenish trvá pouhých pět měsíců.

***

V té době jsem byl novinář a snažil jsem se držet krok s objevy souvisejícími s CRISPR. Ale velmi brzy se průvod zvířat upravených systémem CRISPR změnil v pandemonium. Vědci změnili DNA u zebřiček a motýlů, bíglů a prasat. V roce 2014 mi bylo jasné, že se mi před očima rýsuje něco opravdu grandiózního. Biologové začali mluvit o svých životech před a po CRISPR. Plně jsem si ale uvědomil důležitost CRISPR pro vědce, když jsem jednoho jarního dne šel do Cold Spring Harbor, abych ho strávil v obřím skleníku se skleněným stropem, který má stejný tvar jako katedrála.

Botanik Zachary Lippman mě vedl úzkou uličkou mezi řadami květináčů, z nichž každý měl rostlinu rostoucí kolem kůlu. I když byl můj partner ještě mladý, přes jeho černé vousy se rýsovalo několik pramenů šedých vlasů. Myslel jsem si, že ho tak mohla ovlivnit přítomnost šesti dětí, které si s manželkou do té doby už stihli pořídit. Lippmann zavtipkoval: „Říkají, že dělám genetiku v práci, a pak se vrátím domů a pokračuji v genetice tam.“

Lippmann není první, kdo se pyšní svými rostlinami. Na farmě v Connecticutu, kde budoucí výzkumník vyrůstal, se naučil pěstovat obří dýně. V období intenzivního přibírání přidávali 5-7 kg denně. „Zajímalo mě, jak tahle věc, sakra, roste tak obrovská a jak ji můžete ještě zvětšit,“ řekl.

Na Cornellově univerzitě se Lippman specializoval na rostlinnou vědu a genetiku. Tam zjistil, že vědci se dlouho zabývali jeho dětinskou otázkou, a to nejen ve vztahu k dýním, ale i k jiné zelenině a ovoci. Jednou z hlavních změn, které přinesla zemědělská revoluce, bylo zvýšení velikosti plodin: z krátkých klasů teosinte se staly dlouhé kukuřičné klasy a světlé kořeny divoké mrkve nabobtnaly do silných oranžových kořenů.

Pomocí klasických metod genetiky našli vědci některé z mutací, které tyto změny umožňují. Lippman zjistil, že velká část této práce byla provedena na rajčatech, protože jsou vhodná pro genetické experimenty. Lippmann šel ve vědeckých stopách svých předchůdců a také se pustil do studia rajčat.

„Podívej se na ty malinké bobule,“ řekl mi Lippmann. Zastavil se pod rostlinou visící nad ním. Uchopil stonek a opatrně vzal ovoce. „Tato rostlina je nejbližší známý příbuzný první domestikované formy rajčete,“ vysvětlil.

Domestikace rajčat peruánskými původními farmáři proměnila borůvky velikosti borůvek ve velké plody, které vidíme na pultech supermarketů a na zemědělských výstavách. Lippmannův výzkum pomohl zjistit, jak se prvním šlechtitelům podařilo zvětšit velikost plodů. Ukázalo se, že museli změnit tvar květiny.

Když se z pupenu vyvine květ, nejprve vytvoří klíny zvané „loculi“. Z těchto lokulů se tvoří části květu rajčete. Vycházejí z nich i komůrky plodu. Existuje gen, který určuje, kolik lokules bude mít daná rostlina. Mutace v tomto genu způsobí, že rostlina produkuje více lokules. A zvýšení jejich počtu dává větší ovoce.

V procesu domestikace mutoval nejen gen, který řídí vývoj lokules. Lippman zjistil, že jak se rajčata rozšířila do různých zeměpisných šířek, změnila se jejich reakce na určitou délku denního světla.

Lippman a jeho kolegové zjistili, že divoká rajčata rostoucí v rovníkové oblasti Jižní Ameriky jsou přizpůsobena skutečnosti, že denní světlo v těchto částech trvá 12 hodin po celý rok. Když vědci přivezli divoká rajčata z Galapág do přístavu Cold Spring Harbor, ukázalo se, že rostliny jsou zde špatné – kvůli dlouhému newyorskému letnímu dni. Rajčata reagovala na další sluneční záření syntetizací proteinů, které potlačují kvetení a oddalují růst plodů až do konce tohoto období. Odrůdová rajčata, která rostou v Evropě a Severní Americe, však získala mutace, které v létě snižují produkci těchto proteinů.

V roce 2013 se Lippmann dozvěděl, že vědci přišli na to, jak použít CRISPR k úpravě rostlinných genů. Získal správné molekuly a otestoval je na rajčatech. Ze všech genetických technologií, které kdy použil, ho tato přivedla nejblíže k vyřešení problému.

Jednou z prvních položek na seznamu bylo zajistit, aby rajčata neprodukovala proteiny, které brání kvetení v reakci na dlouhé denní světlo. Pomocí CRISPR vědci vyřízli přepínací gen pro tuto reakci z domestikovaných rajčat. A když Lippman a jeho kolegové naklíčili upravená semena, rostliny vykvetly a přinesly plody dva týdny před plánovaným termínem. To znamenalo, že mohly být od nynějška používány v oblastech s kratším létem. Lippman říká, že „teď by bylo hezké přemýšlet o pěstování našich nejlepších odrůd rajčat v ještě severnějších zeměpisných šířkách, například v Kanadě.“

Lippmann ve skutečnosti vytvořil novou zemědělskou odrůdu v jednom kroku. Na rozdíl od Luthera Burbanka [slavný americký šlechtitel rostlin, 1849-1926] už nemusí hledat tisíce rostlin pro jednoho nadějného mutanta. K vytvoření geneticky modifikované odrůdy nepotřebuje transplantovat geny jiného organismu do rajčete. Přímo změnil geny rostliny pomocí svých znalostí fyziologie rajčat.

12 zdravých potravin, které jsou stejně chutné jako nezdravé

Tento úspěch přiměl Lippmannův tým ke stanovení většího cíle. Vědci se rozhodli ochočit divokou rostlinu. A pro své experimenty si vybrali physalis.

Vědec mě ujistil, že nebudu schopen ocenit to, co udělal, dokud neochutnám toto bobule. Přinesl plastovou nádobu, která byla plná zlatavě zbarveného ovoce, tvaru a velikosti malých skleněných kuliček. Když jsem se zakousl do physalis, ucítil jsem bohatou chuť, něco mezi pomerančem a ananasem. Bobule byly tak chutné a originální, že jsem se dokonce divil, proč jsem je nikdy předtím nezkusil. Důvodem bylo to, jak mi Lippmann vysvětlil, že tyto rostliny nebyly domestikované.

Physalis jsou široce rozšířeny v Severní a Jižní Americe. Rostou do malých keříků a tvoří plod uvnitř suché lucernovité skořápky. Domorodí Američané sbírali physalis k výrobě omáček a evropští osadníci je následovali. Někdo sbíral semena této rostliny a pěstoval je ve svých zahradách. A dnes si můžete koupit sáček semen physalis a jejich plody se prodávají na farmářských trzích a v gurmánských obchodech. Vzhledem k tomu, že physalis jsou divoké rostliny, jsou nadále považovány za něco neobvyklého ve srovnání se zemědělskými plodinami. Plody dlouho dozrávají a střídají se, takže zahradníci musí se sběrem počkat, až všechny bobule spadnou na zem. Někdy se physalis nazývá hliněná brusinka.

Lippmann se o physalis zajímá již dlouho, protože tato rostlina patří do stejné čeledi jako rajčata. Jejich evoluční blízkost znamená, že mají v biologii mnoho společného. Například květ v physalis i rajčatech se tvoří z lokuly a příbuzné geny tento proces regulují. Lippmanna překvapilo, že rajčata byla domestikovaná, zatímco jejich blízcí příbuzní, physalis, nikoli.

Jedna z příčin těchto rozdílů může spočívat ve skutečnosti, že DNA physalis není tak snadné „zdomácnit“. Rajčata, stejně jako lidé, mají dvě kopie každého chromozomu. Ale Physalis má čtyři! K fixaci určitého znaku u physalis je nutné zajistit, aby odpovídající mutace byla ve všech čtyřech kopiích. Lippmanna napadlo, že by místo toho mohl upravit mutace přímo v genech Physalis pomocí CRISPR.

Botanik sklouzl uličkou, rameny se otřel o listy, a přistoupil k physalis modifikovanému CRISPR. Před pár dny rostlina uschla a opadaly jí okvětní lístky. Sepaly vyrostly a vytvořily lucernu, která obklopí vyvíjející se ovoce.

V běžné physalis se tato lucerna skládá z pěti kališních lístků. Lippmann začal trhat sepaly na své upravené rostlině a současně počítal: „Jedna, dva, tři, čtyři, pět, šest, sedm.“

Jakmile odstranil všechny sepaly, objevila se malá bobule physalis. Měl sedm lokusů místo obvyklých pěti.

Lippmann se v blízké budoucnosti pokusí o další změny. Plánuje upravit gen, který řídí, kdy přesně plody padnou, aby farmáři při jejich hledání nemuseli opakovaně prohledávat celý povrch země pod keři. Chce upravit rychlost dozrávání plodů tak, aby všechny bobule dozrávaly současně, a ne po dávkách, jako je tomu nyní, a také změnit reakci physalis na světlo, aby se plody začaly tvořit dříve. Výzkumník také plánuje získat rostliny stejné výšky, aby zemědělci mohli používat stroje ke sklizni.

20 faktů o tom, jak funguje vaše tělo – podívejte se do galerie:

Lippmann chce začít změnou jedné funkce po druhé. Pokud uspěje, pak se chystá vytvořit sadu vodících RNA, které mohou změnit všechny vlastnosti najednou v jedné rostlině. Když se takové physalis začnou množit, jejich potomci získají všechny potřebné geny, které je změní z divokých rostlin na kulturní.

„Vím, že to zní trochu směšně,“ připustil Lippman, „ale myslím, že to bude další úroda bobulí.“ Po vyslechnutí jeho plánu jsem si myslel, že to vůbec není směšné. Myslel jsem, že Lippmann je skromný. Snaží se ve zrychleném tempu zopakovat zemědělskou revoluci. Místo tisíce let potřebuje pouze jedno vegetační období.

***

Pro CRISPR neexistuje téměř žádný rozdíl mezi physalis a lidmi: jejich DNA se štěpí stejně snadno.

Vědci rychle začali používat CRISPR k úpravě genů v lidských buňkách, aby našli odpovědi na otázky, které se kdysi zdály neřešitelné. Každý z nás má přibližně 20 000 genů kódujících proteiny a tisíce genů, které kódují molekuly RNA. Ale kolik jich skutečně potřebujeme? Pokud mutace vypne některé geny, vede to k smrtelným dědičným chorobám. Přesto, navzdory výsledným zlomeným genům, je mnoho z nás v dobrém zdraví. Vědci si dlouho kladli otázku, kolik genů člověk nezbytně potřebuje k přežití. Zároveň pochopili, že takový katalog nelze sestavit.

Systém CRISPR to umožnil. V roce 2015 použily tři nezávislé výzkumné týmy CRISPR k vypnutí všech genů kódujících protein, aby zjistily, zda by buňka mohla přežít bez konkrétního genu. Výsledkem byly téměř stejné seznamy. Přibližně 2 000 genů se ukázalo jako nepostradatelné, tj. přibližně 10 % genů kódujících proteiny lidského genomu. Experimenty ukázaly, že mnoho genů se může pokazit, protože mají výpadky. Pokud některé selžou, jejich funkce převezmou jiné.

Řada vědců zahájila experimenty s CRISPR a lidskými buňkami, aby vytvořili nový typ léku. V prosinci 2013 skupina nizozemských vědců ukázala, jak může medicína CRISPR fungovat. Odebrali buňky pacientům s cystickou fibrózou a v laboratoři vypěstovali kolonii takových buněk. Všichni měli stejnou mutaci v genu cftr. Vědci navrhli systém CRISPR, aby tuto mutaci vyřízli, a poté vložili funkční verzi genu na správné místo.

Ve stejném prosinci zveřejnil tým vědců ze Šanghajského institutu biologických věd v Číně výsledky experimentu provedeného na myších s dědičným šedým zákalem. Vědci zavedli do zygoty molekuly CRISPR, které zafixovaly mutovaný gen. Ze změněných myší se vyvinuli plodní dospělí a jejich potomci se dívali na svět jasnýma očima.

Počáteční radost Jennifer Doudnové postupně začala ustupovat úzkosti. Systém CRISPR se ukázal být silnějším nástrojem, než očekávala. Xingxu Huang, genetik z China Animal Research Center na Nanjing University, a jeho kolegové upravili tři geny v opičích embryích pomocí CRISPR. Embrya vědci implantovali do těla samice a po uplynutí stanovené doby porodila zdravá dvojčata. Pokud tato zvířata mají své vlastní děti, zdědí také geny upravené pomocí CRISPR.

Jistý novinář v lednu 2014 poslal Dudně návrh článku o opicích a požádal ji o komentář. Po přečtení textu se nestačila divit, kdy proběhnou první pokusy na lidských embryích. A právě tehdy výzkumníka začaly pronásledovat noční můry.

Někdy se Dudně zdálo o tom, jak stála sama na pláži na Havaji (tam vyrostla). V dálce vidí nízkou vlnu, která se řítí přímo k ní, a po chvíli si uvědomí, že je to vlastně tsunami. Po prvním vyděšení najde surf a jde rovnou za vlnou. V dalším opakujícím se snu ji kolega vědec požádal, aby se setkala s někým mocným. Vstoupí do místnosti. Ukáže se, že mocný muž je Hitler. Ve snu Dudna má místo obličeje prasečí rypák. Stojí k ní zády a rychle něco píše. „Chci porozumět možnostem a důsledkům této úžasné technologie,“ řekl jí Hitler s čenichem.

Dudna se probudil s bušícím srdcem. „Co jsme udělali?“ zeptala se sama sebe.